Строение белковых молекул. Практически все Б. построены из 20 аминокислот, принадлежащих, за исключением глицина, к L-ряду. Аминокислоты соединены между собой пептидными связями, образованными карбоксильной и аминогруппами соседних аминокислотных остатков (см. ф-лу I):

Белковая молекула может состоять из одной или неск. цепей, содержащих от 50 до неск. сотен (иногда - более тысячи) аминокислотных остатков. Молекулы, содержащие менее 50 остатков, часто относят к пептидам. В состав мн. молекул входят остатки цистина, дисульфидные связи которых ковалентно связывают участки одной или неск. цепей.

В нативном состоянии макромолекулы Б. обладают специфич. конформацией. Характерная для данного Б. конформация определяется последовательностью аминокислотных остатков и стабилизируется водородными связями между пептидными и боковыми группами аминокислотных остатков, а также гидрофобными и электростатич. взаимодействиями. Большое влияние на конформацию оказывают взаимод. Б. с компонентами среды (вода, липиды и др.), в которой они функционируют.

Различают четыре уровня организации белковых молекул. Последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи наз. первичной структурой. Все Б. различаются по первичной структуре; потенциально возможное их число практически неограничено. Термин "вторичная структура" относится к типу укладки полипептидных цепей. наиб. часто встречающиеся типы-правая спираль и структура. Первая характеризуется планарностью пептидной группы; водородные связи между СО-и NH-группами пептидной цепи замыкают циклы из 13 атомов (рис. 1). На 1 виток спирали приходится 3,6 остатка аминокислот, шаг спирали -0,544 нм. Значительно менее энергетически выгодны правые 3₁₀- и спирали, содержащие соотв. 3 и 4,4 аминокислотных остатка на 1 виток, а также 10 и 16 атомов в циклах, образованных водородными связями. 3₁₀-Спирали встречаются сравнительно редко и образуют только очень короткие участки, которые обычно располагаются на концах спиралей. Предсказанные теоретически правые спирали, а также левые 3₁₀- и спирали в Б. не обнаружены.

В случае структуры, или структуры складчатого листа, полипептидные цепи растянуты, уложены параллельно друг другу и связаны между собой водородными связями. Остов цепи не лежит в одной плоскости, а вследствие небольших изгибов при углеродных атомах образует слегка волнистый слой. Боковые группы располагаются перпендикулярно плоскости слоя. В Б. обнаружены два вида структуры: с параллельным и антипараллельным направлениями цепей (рис. 2). Частный случай структуры- изгиб, обеспечивающий поворот пептидной цепи на угол ок. 180° на протяжении отрезка, содержащего 4 аминокислотных остатка; 1-й и 4-й остатки соединены водородной связью. Относительное содержание спиральных участков и структур может широко варьировать. Существуют Б. с преобладанием спиралей (ок. 75% в миоглобине и гемоглобине), тогда как осн. тип структуры многих фибриллярных Б., в т.ч. фиброина шелка и кератина волос,- структура. У многих Б. содержание и структурных участков незначительно, однако и в этих случаях полипептидные цепи укладываются в пространстве строго определенным, характерным для каждого Б. образом.

Под третичной структурой Б. понимают расположение его полипептидной цепи в пространстве. Существ. влияние на формирование третичной структуры оказывают размер, форма и полярность аминокислотных остатков. В молекулах глобулярных Б. большая часть гидрофобных остатков скрыта внутри глобулы, а полярные группировки располагаются на ее пов-сти в гидратированном состоянии. Однако ситуация не всегда настолько проста. Связывание белка с др. молекулами, напр. фермента с его субстратом или коферментом, почти всегда осуществляется с помощью небольшого гидрофобного участка на пов-сти глобулы. Область контакта мембранных Б. с липидами формируется преим. гидрофобными остатками. Третичная структура многих Б. составляется из неск. компактных глобул, наз. доменами (рис. 3). Между собой домены обычно бывают связаны "тонкими перемычками" - вытянутыми полипептидными цепями. Пептидные связи, расположенные в этих цепях, расщепляются в первую очередь при обработке Б. протеолитич. ферментами, тогда как отдельные домены м. б. достаточно устойчивы к протеолизу.

Рис. I. Спиральные конформации полипептидных цепей: а-3₁₀-спираль, б- спираль, в- спираль (пунктирные линии-водородные связи).

Рис. 2. Схематич. изображение структур: слева - антипараллельный, справа - параллельный складчатый лист.

Рис. 3. Схематич. изображение трехмерной структуры малатде-гидрогеназы. Участки спиралей (от до ) и структур (от до ) представлены соотв. в виде прямоугольников и прямых линий со стрелками. Структура состоит из двух отчетливо различимых глобулярных областей (доменов). Участок полипептидной цепи, соединяющий домены между собой, показан точечной линией.

Термин "четвертичная структура" относится к макромолекулам, в состав которых входит неск. полипептидных цепей (субъединиц), не связанных между собой ковалентно. Такая структура отражает способ объединения и расположения этих субъединиц в пространстве. Между собой отдельные субъединицы соединяются водородными, ионными, гидрофобными и др. связями. Изменение рН и ионной силы раствора, повышение температуры или обработка детергентами обычно приводят к диссоциации макромолекулы на субъединицы. Этот процесс обратим: при устранении факторов, вызывающих диссоциацию, может происходить самопроизвольная реконструкция исходной четвертичной структуры. Явление носит общий характер: по принципу самосборки функционируют многие биол. структуры. Способность к самосборке свойственна и отдельным фрагментам Б. - доменам. Более глубокие изменения конформации Б. с нарушением третичной структуры наз. денатурацией.

Свойства. Физ.-хим. свойства Б. определяются их высокомол. природой, компактностью укладки полипептидных цепей и взаимным расположением остатков аминокислот. Мол. масса варьирует от 5 тыс. до 1 млн., а константы седиментации - от 1 до 20 (и выше). Средний уд. объем белковых молекул - 0,70-0,75 см³/г, а константы диффузии - 10⁶-10⁸ см²/с. Максимум поглощения Б. в УФ-области спектра, обусловленный наличием ароматич. аминокислот, находится вблизи 280 им. Возбуждение электронов атома азота пептидной группы вызывает резкое увеличение поглощения при 185-240 нм. В ИК-области спектра Б. поглощают за счет СО- и NH-rpyпп при 1600 и 3100-3300 см^-1.

В растворах Б. амфотерны. Изоэлектрич. точки Б. могут иметь значения от < 1,0 (у пепсина) до 10,6 (у цитохрома с) и выше. Боковые группы аминокислотных остатков способны вступать во многие реакции. Б. дают ряд цветных реакций, обусловленных наличием определенных аминокислотных остатков или хим. группировок. К важнейшим из них относятся: биуретовая реакция (пептидные связи), ксантопротеиновая реакция (ароматич. ядра остатков тирозина, триптофана, фенилаланина), Адамкевича реакция (индольное кольцо триптофана), Мил лона реакция (фенольный радикал тирозина), Паули реакция (имидазольное кольцо гистидина), Сакагучи реакция (гуанидиновая группа аргинина) и нингидриновая реакция (аминогруппа).

Выделение. Один из первых этапов выделения Б. - получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматич. мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее Б. переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными растворами солей и детергентов, иногда - неполярными р-рителями. Затем применяют фракционное осаждение неорг. солями [обычно (NH₄)₂SO₄], этанолом, ацетоном или путем изменения рН, ионной силы, температуры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. температуре (ок. 4°С); с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, некоторые Б. стабилизируют полиолами, например глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных Б. или группы гомологичных Б. наиб. распространенные методы разделения-гель-проникающая хроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография; эффективные методы-жидкостная хроматография высокого разрешения и аффинная хроматография.

Критерий чистоты Б. - гомогенность при электрофорезе, хроматографии и ультрацентрифугировании. Одноцепо-чечный Б. должен быть гомогенным при N- и С-концевом анализе (см. ниже). Примесь сопутствующих ферментов определяют с помощью специфич. субстратов; высокую чувствительность имеют иммунохим. методы (обычно до 10^-3 мкг/мл примесного антигена).

Методы исследования первичной структуры. Знание первичной структуры Б.-основа для определения его вторичной и третичной структур, выяснения расположения функц. групп в активном центре Б. и построения модели его функционирования. Исследование первичной структуры мутантных Б. позволяет на молекулярном уровне характеризовать различия между штаммами микроорганизмов, фагов и вирусов, выяснять молекулярные причины генетич. болезней. Данные по первичной структуре используют при установлении и проверке таксономич. взаимоотношений между разл. видами живых организмов, построении фило-генетич. древа и анализе хода биол. эволюции.

Для определения аминокислотной последовательности Б. прежде всего разделяют его полипептидные цепи (если макромолекула состоит из неск. цепей). Затем определяют аминокислотный состав цепей, N- и С-концевые аминокислотные остатки и аминокислотные последовательности. Полипептидные цепи подвергают специфич. расщеплению протеолитич. ферментами или хим. реагентами. Смесь образовавшихся фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность. При необходимости крупные фрагменты дополнительно расщепляют к.-л. способом на более мелкие. Порядок расположения фрагментов выясняют путем расщепления молекулы Б. по др. связям и анализа образующихся при этом "перекрывающихся" фрагментов.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого Б. или пептида и количеств. определение всех аминокислот в гидролизате. Для гидролиза обычно используют 5,7 н. водный раствор НС1, а при анализе содержания триптофана - 4 н. метансульфоновую кислоту, содержащую 0,2% 3-(2-аминоэтил)индола, или кипячение со щелочью. Количеств. определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких приборов смесь аминокислот разделяют на ионообменных колонках, детекцию осуществляют спектрофотометрически по реакции с нингидрином или флуориметрически с использованием флуорескамина или о-фталевого диальдегида. В последнем случае можно анализировать до 0,1-0,05 нмоль аминокислоты.

Наиб. распространение для определения N-концевых остатков находит дансильный метод. Его первая стадия -присоединение дансилхлорида (1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорида) к непротонированной аминогруппе с образованием дансилпептида (ДНС-пептида). Затем последний гидролизуют 5,7 н. раствором НС1 при 105 °С, в результате чего освобождается N-концевая ДНС-аминокислота, которая обладает интенсивной флуоресценцией в УФ-области спектра; для ее идентификации достаточно 0,1-0,5 нмоля вещества.

Для определения С-концевых остатков чаще всего используют ферментативный гидролиз карбоксипептидазами, которые специфически расщепляют пептидные связи, образованные С-концевыми остатками. Поскольку после отщепления концевых остатков фермент атакует послед. пептидные связи, измерение скорости отщепления отдельных аминокислот позволяет анализировать также и С-концевую аминокислотную последовательность.

Важнейший этап в определении первичной структуры Б. - расщепление макромолекулы на пептидные фрагменты. Среди ферментативных методов расщепления наиб. широко используется гидролиз трипсином. Трипсин обладает уникальной субстратной специфичностью: гидролизует исключительно связи, образованные карбоксильными группами осн. аминокислот - лизина и аргинина. Введение заместителей в боковые цепи лизина или аргинина препятствует гидролизу по остаткам модифициров. аминокислот и позволяет гидролизовать макромолекулы избирательно только по остаткам аргинина или лизина. Особенно часто используется модификация остатков лизина с послед. гидролизом Б. по остаткам аргинина. Модифицирующие агенты - ангидриды дикарбоновых кислот (янтарной, малеиновой и цитраконовой). Из др. протеолитич. ферментов широко применяется протеаза из Staphylococcus aureus (гидролизует связи, образованные карбоксильными группами остатков глутаминовой кислоты, а в некоторых случаях и остатков аспарагиновой кислоты), а также химотрипсин и термолизин. Последние ферменты обладают более широкой специфичностью. Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматич. аминокислот - тирозина, фенилаланина и триптофана. С меньшей скоростью гидролизуются связи лейцина, метионина и гистидина. Термолизин преим. расщепляет связи, образованные аминогруппой остатков с гидрофобной боковой цепью (изолейцин, лейцин, валин, фенилаланин, тирозин, триптофан).

Из химических методов расщепления Б. наиболее специфичный и чаще всего применяемый -бромциановое расщепление по остаткам метионина (выход 90-100%):

Для расщепления Б. по карбонильной группе остатка триптофана используют N-бромсукцинимид или более селективный 2-(2-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3-броминдол (BNPS-скатол) (выход Ю-50%):

Гидроксиламин расщепляет пептидные связи между остатками аспарагина и глицина. При его взаимод. с циклич. имидом ангидроаспартилглицина, спонтанно образующегося из аспарагинилглицина, в щелочной среде происходит расщепление пептидной цепи с образованием смеси и аспартилгидроксаматов:

В ряде случаев для расщепления Б. используется метод частичного кислотного гидролиза. наиб. чувствительны к действию кислот аспартильные пептидные связи и особенно связь аспартил - пропил.

При выборе методов разделения пептидов учитывают физ.-хим. свойства, кол-во и длину молекул разделяемых соединений. Для первичного фракционирования смесей коротких пептидов, содержащих до 15-20 аминокислотных остатков, в большинстве случаев используют ионообменную хроматографию на катионитах. Дальнейшее разделение и очистку проводят с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге или пластинках с тонким слоем целлюлозы или силикагеля.

Осн. сложность при фракционировании молекул крупных пептидов (более 20 аминокислотных остатков) - их свойство слипаться в водных растворах друг с другом с образованием высокомол. агрегатов, не поддающихся разделению. Для предотвращения агрегации в буферные растворы вводят мочевину (до 8 М), гуанидинийхлорид (до 6 М) или детергенты (додецилсульфат Na); разделение часто проводят с помощью гель-проникающей хроматографии и ионообменной хроматографии. Эффективный метод разделения - жидкостная хроматография высокого разрешения на носителях с обращенной фазой. Для селективного выделения пептидов, несущих химически активные группировки, м. б. использована хемоспецифич. (ковалентная) хроматография, основанная на образовании ковалентной связи пептида с носителем. Напр., для выделения цистеинсодержащих пептидов используют р-цию тиол-дисульфидного обмена, с помощью которой пептиды через дисульфидный мостик присоединяются к модифицированному 2,2'-дипиридилдисульфидом носителю. Ковалентно связанные с носителем цистеинсодержащие пептиды м. б. легко элюированы при послед. обработке меркаптоэтанолом.

Осн. метод исследования аминокислотной последовательности пептидов и Б. - хим. деградация с помощью фенилизотиоцианата. Этот метод позволяет последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов, которые абсорбируют свет в УФ-области с максимумом поглощения 265-270 нм. Для их идентификации наиб. часто используют тонкослойную хроматографию, жидкостную хроматографию высокого давления, а также масс-спектрометрию. Широкое применение нашел также метод, сочетающий последовательную деградацию пептида по Эдману (см. Эдмана деградация) с анализом N-концевых аминокислотных остатков в виде их дансильных производных. Достоинство метода -его высокая чувствительность.

Для непосредственного анализа первичной структуры Б. обычно используют секвенатор - прибор, который с высокой эффективностью осуществляет последовательное авто-матич. отщепление N-концевых аминокислотных остатков путем деградации Б. по методу Эдмана. Все реакции проводятся в цилиндрич. стеклянном стаканчике, вращающемся с постоянной скоростью в атмосфере инертного газа (рис. 4). Образец Б. распределяется на стенках стаканчика в виде тонкой пленки. Оптимизация процесса и тщательная очистка используемых реагентов и растворителей позволили поднять общий выход реакции до 95% и выше. Наилучшие объекты для секвенатора - Б. и пептиды, содержащие в своем составе от 60 до 200 аминокислотных остатков; для таких соединений обычно удается определять последовательность 30-35 (в ряде случаев 40-50) остатков. Для анализа коротких пептидов более эффективен подход, заключающийся в их ковалентном присоединении к нерастворимому носителю. Этот принцип положен в основу твердофазного секвенатора, где реакц. "сосудом" служит хроматографич. колонка, с носителем которой ко валентно связан исследуемый пептид. Через колонку последовательно пропускают реагенты и растворители. Носителями чаще всего служат полистирол и пористое стекло. В кач-ве функц. группы, реагирующей с пептидом, обычно используется алифатич. или ароматич. аминогруппа. Для присоединения к носителю пептидов, образующихся в результате бромцианового расщепления, используют высокую реакц. способность С-концевого лактона гомосерина. Лизинсодержащие пептиды м. б. присоединены за счет аминогруппы путем конденсации с n-фенилендиизотиоцианатом. Остальные пептиды присоединяют по С-концевой карбоксильной группе карбодиимидным методом. Третье поколение приборов - газофазные секвенаторы, в которых образец наносится на небольшой (диаметр ок. 5 мм) диск из пористого стеклянного волокна, а все реагенты подаются в газовой фазе. Таким способом анализируют микроколичество вещества ( < 100 пкмоль).

Рис. 4. Схема реакц. камеры секвенатора.

При определении аминокислотной последовательности пептидов находит применение также масс-спектрометрия. В этом случае используется способность ионизиров. молекул пептидов распадаться по т. наз. аминокислотному типу фрагментации, заключающемуся в разрыве СО—NH или —СО связей:

Идентификация в масс-спектре пиков, соответствующих фрагментам А₁...А_пили а₁...а_п, дает информацию о строении пептида.

Наиб. сложные проблемы возникают при изучении первичной структуры мембранных Б., а также Б., выделяемых в ничтожно малых кол-вах или имеющих большую мол. массу (> 100000). Ряд этих проблем решен благодаря разработке быстрых и эффективных методов анализа нуклеотидной последовательности ДНК. Поскольку первичная структура любого Б. закодирована в нуклеотидной последовательности соответствующего ей участка ДНК, то определение последней позволяет с помощью генетич. кода автоматически устанавливать и соответствующую аминокислотную последовательность. При этом оказалось особенно эффективным параллельное изучение первичных структур Б. и ДНК. Такой подход резко ускоряет проведение исследований и значительно повышает достоверность результатов.

Методы изучения пространственной структуры. При изучении пространств. структуры Б. существует два принципиальных подхода: исследование в растворе и в кристаллич. состоянии. Осн. метод, дающий непосредственную информацию о пространств. расположении атомов в молекуле Б., - рентгеноструктурный анализ. Он применим только для хорошо кристаллизующихся Б. При этом наряду с кристаллом нативного Б. необходимо получать производные, содержащие тяжелые атомы, которые были бы изоморфными исходному Б., т.е. давали бы подобные кристаллич. структуры. Тяжелый атом вводится в молекулу Б. при "вымачивании" кристалла в соответствующем растворе или в процессе кристаллизации. Иногда используют хим. модификацию Б., например n-хлормеркурийбензоатом по SH-группам.

Интерпретация карт электронной плотности молекулы значительно облегчается при знании аминокислотной последовательности. Однако далеко не каждый Б. удается получить в кристаллич. состоянии. Необходимое условие кристаллизации - сохранение нативной конформации, которая часто реализуется лишь в условиях, приближенных к физиологическим. В частности, Б., входящие в состав нуклеопротеидных комплексов (рибосома, вирусы), хорошо кристаллизуются только в составе таких комплексов. С помощью обычного рентгеновского излучения проводить анализ таких гигантских образований сложно. В этих случаях используют синхротронное рентгеновское излучение, интенсивность которого может быть на два порядка выше. Вследствие этого резко сокращается время эксперимента по регистрации дифракц. отражений, а также снижается кол-во исследуемого вещества. Ряд мембранных Б. кристаллизуется в условиях нативного липидного окружения с образованием т. наз. "двухмерных" кристаллов, представляющих из себя регулярно упакованные молекулы Б. в бислойной лииидной мембране. При изучении двухмерных кристаллов используют электронную микроскопию и электронографию.

Во мн. случаях хорошие результаты получают, применяя нейтронографию. Нейтроны, имея низкую энергию, в отличие от рентгеновских лучей не разрушают кристаллы Б., в результате чего можно получить полный набор дифракц. данных от одного кристалла. С использованием этого метода удается локализовать в структуре Б. отдельные атомы водорода, а также расположение молекул кристаллизац. воды.